巴斯德細菌致病理論的提出，李斯特的消毒滅菌法都進一步激發了他要探索細菌是怎樣致病這個奧秘的決心。盡管行醫非常繁忙辛苦，但他抓住一切可以利用的時間，在十分簡陋的條例下，開展研究。深深理解他的妻子，在他30歲生日時，送給他一件珍貴的禮物——一台嶄新的精密顯微鏡，從此這台顯微鏡就伴隨著科赫，用它科赫做出了一個又一個重大的發現。

    科赫在世界上首次以確鑿的事實證明了炭疽菌是引起炭疽病的罪魁禍首。

    當時，在歐洲的許多地區，牛羊中流行著一種可怕的炭疽病，昨天還活蹦亂跳的牛羊，第二天就直挺挺地倒下了，它們的血變成黑色。有時牛羊的主人也會傳染上這種病，身上長出大癤子，嚴重的在一陣陣咳嗽聲中死去。

    科赫從農民那兒和屠宰廠找來許多患病的和健康的牛羊的血液，放在顯微鏡底下觀察，他發現，患病的牛羊血液中有許多小棍狀和線狀的微生物，而健康牛羊則沒有。

    早在科赫之前，有好幾位科學家，包括巴斯德都已經發現患炭疽病的牛羊體內有這種杆狀和線狀的細菌了，但怎樣證明就是它們引起炭疽病的呢？

    科赫找來一些小白鼠，把它們尾巴根部切開一個小口，然後用消毒過的木片蘸上一滴病死的牲畜的血液刮進切口。第二天，小鼠就可憐地死去了，它們的脾變得又黑又大。取一滴小鼠的血液在顯微鏡下觀察，又可以看到那種可怕的杆狀和線狀細菌了。

    但是科赫還不肯輕易下結論，他是一個極其嚴謹的科學家，“要證明這些細菌是炭疽病的病源，除非能把這種細菌分離出來，看到它們生長、繁殖、引起疾病。”他想。

    為了防止其他雜菌混入，科赫巧妙地設計了兩片貼得很緊、中間有凹槽的玻璃片，裏邊放了一滴牛眼分泌液做營養物質，取了一點剛死去的小鼠的脾放在液滴中。他把這個裝置放在顯微鏡下觀察，這些杆狀細菌分裂成兩半，成百萬倍地繁殖著。

    科赫從這個標本中取出一點點液體移到另一滴牛眼分泌液中繼續培養，這樣反複了8次，直到液滴中沒有一點小鼠組織，完全是純的炭疽菌為止。

    科赫把這種體外培養的炭疽菌注射到羊、豚鼠、兔子等身上，結果它們都患炭疽病死去。

    現在，科赫可以做結論了，正是炭疽菌引起了炭疽病。他激動地寫信把他的發現報告給著名的植物學家柯恩。

    1876年4月30日，應柯恩邀請，這位鄉村醫生坐火車專程到布雷斯勞，在植物學會上連續3天演示了他的實驗。他的實驗是那樣完美無缺，轟動了整個科學界。

    要證明一種細菌引起一種病，必須獲得單一的這種細菌。從巴斯德開始，人們就是用肉湯來培養細菌，各種各樣的菌混在一起，要把它們分開非常困難。怎樣才能方便地獲得純種細菌呢？科赫日夜思索著這個問題。

    一天早上，科赫來到廚房，無意中發現一個煮熟的土豆，上邊長出了一些紅色和白色的斑點，作為細菌學家的科赫馬上想到，這是細菌落在上邊了，可是為什麽這些斑點的顏色不一樣呢？他用一根針挑了一點斑點上的物質放在顯微鏡下觀察，發現原來一種顏色的斑點上全是一種細菌，另一種顏色的斑點上又全是另一種細菌，也就是說在固體上，細菌不能自由移動了，這一發現使科赫驚喜萬分。

    不過土豆的營養太少了，好多細菌不能在上邊生長繁殖。經過反複實驗，科赫終於發明了用肉湯加洋菜做成的半固體膠狀的培養基，用針尖把一個細菌挑在這種培養基上，很快就會繁殖出一個純的菌落。

    科赫還首先采用染色法給細菌染色，以觀察細菌的形態，他還為顯微鏡下的細菌拍照，這些方法為人們捉拿“殺人凶手”提供了有力武器，致病的細菌一個個被分離出來，在顯微鏡下顯出原形。

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