767.鎖定(2/4)

    單細胞測序可以進一步探索腫瘤內的異質性。與流式細胞術、質譜法或其他任何以前的方法不同，單細胞測序是一種連續的方法，而不是離散的方法。scRNA-seq的步驟主要包括以下四個步驟:(1)單細胞分離，(2)反轉錄成cDNA，(3)PCR擴增cDNA，(4)測序庫構建(圖1a)。熒光激活細胞分選(FACS)可用於從組織中分離特定的細胞(圖1a)。在B細胞研究方麵，采用流式細胞術篩選CD45 細胞，增加B細胞的比例；也可根據B細胞標記物直接選擇靶向B細胞。作為scRNA-seq技術的突破，微流控係統將單個細胞封裝在獨立的微液滴中，該微液滴包含一個獨特的分子標識符(UMI)，用於對單細胞內的微轉錄材料進行條形碼。根據每個細胞的UMI，即使細胞被裂解，在後續的分析中也可以找到轉錄信息。基於這一特點，10×GenomicsChromium平台同時測序數千個細胞。與Smart-seq2等低通量方法相比，10×GenomicsChromium平台因其成本低、效率高而被更廣泛地應用於B細胞檢測。

    在對多種scRNA-seq方法的比較研究中，10×Genomics也比其他高通量方法如Drop-seq和Indrops[33]具有更高的靈敏度，更高的與線粒體基因匹配的reads比例，更低的噪聲。利用10×Genomics和Smart-seq2平台，可以通過不同的免疫球蛋白重鏈特征區分CRC中B細胞的亞群，聚類結果無明顯差異。但是，10×Genomics也有不足之處，它不能覆蓋所有的基因，並且存在3''區域偏倚，在檢測基因突變或mRNA剪接位點時可能會遺漏一些重要信息。此外，這種方法對細胞質量有更高的要求，不同的組織和不同的獲取樣本的方法都不同。利用scRNA-seq，我們可以更精確地定義細胞的亞型，追蹤它們的發育譜係，確定克隆型和表現型之間的關係，繪製不同細胞之間的相互作用和空間關係圖，從而從多個維度描述TME。此外，還需要通過一係列體內和體外實驗來驗證結果。我們總結了使用scRNA-seq研究的最新出版物

    B細胞受體(Bcellreceptor，BCR)是一種能識別並結合特異性抗原的膜免疫球蛋白，在B細胞的分化成熟過程中起著重要作用。BCR由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，其中可變(V)、多樣性(D)和連接(J)基因序列的重組創造了B細胞的多樣性。這種多基因的複雜性使得鑒別不同的受體變得困難。然而，由於每個B細胞通常表達一個單一的受體，潛在的抗原特異性受體可以通過給定的原細胞鏈發現。BCR的兩個主要功能如下。首先，它通過誘導B細胞激活過程中肌動蛋白骨架的實質改變和各種基因的表達來激活B細胞。其次，它介導抗原的鑒定和提取，從而導致加工過的肽在主要組織相容性複合體II(MHCII)上呈現給T輔助細胞。因此，BCR測序有助於進一步了解B細胞分化的軌跡及其特異性識別抗原性的機製，特別是當與單個B細胞的完整轉錄組身份配對時，這為了解癌症的發展提供了線索。更重要的是，BCR測序可以追蹤來自單細胞的群體，揭示克隆型和表型之間的關係。ScRNA-seq技術在BCR測序中具有天然優勢，因為含有UMI的微流控係統可以保證同源VH-VL配對的保存，而這些同源VH-VL配對在B細胞批量測序中可能會丟失。BASIC是一個在單細胞分辨率上進行BCR測序的平台。作為重建配對全長BCR序列的工具，BraCeR為B細胞的克隆推斷和譜係追蹤提供了一個完整的管道。LIBRA-seq是一種高通量的方法，將BCRse-序列與其同源抗原特異性連接起來，可以用來繪製特定對象中數千個B細胞的抗原特異性。

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